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English

LightNing? AseI

產(chǎn)品貨號(hào):
  • EG25503S
產(chǎn)品規(guī)格:
100 rxns
產(chǎn)品價(jià)格:
¥240
同裂酶:
PshBI, VspI
識(shí)別位點(diǎn):
ATTAAT

5'...A T ↓ T A A T...3'
3'...T A A T ↑ T A...5'

產(chǎn)品介紹

  LightNing® 快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組的快速限制性內(nèi)切酶,適用于質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。所有 LightNing® 快速內(nèi)切酶在通用的 CutOne® 或 CutOne® Color Buffer 中都具有優(yōu)良的活性,能夠在 5~15 分鐘內(nèi)完成酶切。此外,百時(shí)美去磷酸化、連接試劑在 CutOne® Buffer 中均具有 100% 活性,支持一管化反應(yīng),提升“酶切 - 修飾 - 連接”的體驗(yàn)。

  CutOne® Color Buffer包括紅色和黃色示蹤染料,可將產(chǎn)物直接用于凝膠電泳。CutOne® Color Buffer 的紅色染料與 2500 bp 雙鏈 DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近;黃色染料與 10 bp 雙鏈 DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近。

產(chǎn)品組成

組分

規(guī)格

LightNing® AseI

100 μl

10× CutOne® Buffer

1 ml

10× CutOne® Color Buffer

1 ml

特性和用法

快速內(nèi)切酶,可在5~15 min內(nèi)完成反應(yīng)

 

建議反應(yīng)條件

1× CutOne®緩沖液;

37℃溫育;

參照“DNA 快速酶切流程”配制反應(yīng)體系。

 

失活條件

80℃溫育20 min。

 

甲基化敏感性

對(duì)于被 EcoBI 甲基化的 DNA,剪切可能受阻。

儲(chǔ)運(yùn)條件

-20℃

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相關(guān)問答

  • Q:

    為什么在CutOne® Buffer中加入HSA?

    A:

    一些酶在反應(yīng)過程中需要HSA的參與,我們?cè)贑utOne® Buffer中添加了HSA,避免反應(yīng)中額外添加組分,使得酶切反應(yīng)更加便捷。

  • Q:

    HSA的添加對(duì)于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響?

    A:

    在我們的測(cè)試中未曾發(fā)現(xiàn)HSA對(duì)于雷霆系列限制性內(nèi)切酶的功能有任何影響。在有些情況下,對(duì)于部分的酶切反應(yīng)有促進(jìn)作用。

  • Q:

    為了保證酶量小于體系的1/10多酶切時(shí)往往可加入酶量較少,從而導(dǎo)致酶切不完全,如何解決?

    A:

    說明書中給出的是最佳反應(yīng)體系,可以根據(jù)具體需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

    酶切不完全的問題可以從這幾個(gè)方面進(jìn)行解決:降低底物濃度,提高酶量同時(shí)擴(kuò)大反應(yīng)體系,或者適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

  • Q:

    我需要嚴(yán)格遵守5~15 min的酶切時(shí)間嗎?能夠延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間嗎?

    A:

    雷霆系列限制性內(nèi)切酶經(jīng)過改造可以將酶切時(shí)間縮短至5~15 min。同樣也消除了限制性內(nèi)切酶的星活性(長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)造成的非特異性消化),在說明書中告知的星活性出現(xiàn)的時(shí)間范圍內(nèi)可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。

  • Q:

    酶切反應(yīng)完成后終止反應(yīng)是不是必要的?我該如何終止我的酶切反應(yīng)

    A:

    限制性內(nèi)切酶對(duì)于下游反應(yīng)(連接與轉(zhuǎn)化等)有影響,部分限制性內(nèi)切酶能與雙鏈DNA結(jié)合,對(duì)于凝膠電泳會(huì)產(chǎn)生影響;而且不失活酶切產(chǎn)物不能保存。故反應(yīng)完成后應(yīng)對(duì)其進(jìn)行失活處理。常規(guī)失活方式為高溫?zé)崾Щ?,?duì)應(yīng)各個(gè)限制性內(nèi)切酶的失活溫度請(qǐng)查閱說明書。另,部分上樣染料中含有SDS可使蛋白變性,苯酚或氯仿的萃取也能使反應(yīng)終止。

  • Q:

    我什么時(shí)候應(yīng)當(dāng)考慮星活性對(duì)于酶切反應(yīng)的影響?

    A:

    如果額外的酶切條帶對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響時(shí)我們應(yīng)當(dāng)考慮星活性對(duì)于酶切反應(yīng)的影響。例如:進(jìn)行基因型、突變型分析或克隆時(shí)我們應(yīng)當(dāng)避免星活性的產(chǎn)生。避免星活性的有效方法:適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體積(較小的反應(yīng)體積容易造成甘油體積達(dá)到或超過總反應(yīng)體積的5%);不進(jìn)行超長(zhǎng)時(shí)間孵育(過夜消化極易產(chǎn)生星活性)。

  • Q:

    酶切反應(yīng)的具體操作流程是怎樣的?

    A:

    大部分的科研工作者通常遵循如下流程:1 U限制性內(nèi)切酶可以完全酶切1μg經(jīng)過純化的DNA,總體積為20 μl于1×CutOneTM Buffer環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)。為防止總酶量超過總體積的10%,在雙酶切時(shí)可以適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系。千萬不要孵育超過星活性出現(xiàn)的時(shí)間(星活性出現(xiàn)時(shí)間請(qǐng)查閱各酶說明書)。另外一個(gè)容易被忽略的問題對(duì)于酶切的影響也非常大,在反應(yīng)體系配制完成后完全的混勻才能反應(yīng)完全,推薦用槍頭輕輕吹打3到5次或用手指輕彈管壁,之后用離心機(jī)瞬離即可。不要渦旋反應(yīng)體系,劇烈震蕩對(duì)酶的活性有極大的影響。

  • Q:

    酶切反應(yīng)完成后,沒有看到切割后的跡象,有哪些因素可能對(duì)酶切產(chǎn)生抑制作用?

    A:

    作為酶切反應(yīng)底物的DNA應(yīng)該是純凈的沒有污染的,其中例如:苯酚、氯仿、酒精、EDTA、去污劑、過量的鹽都會(huì)抑制酶切反應(yīng)。部分酶對(duì)于DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)較為敏感,DNA的缺刻、超螺旋都會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生影響。另外很多限制性內(nèi)切酶對(duì)于DNA的甲基化非常敏感,確保DNA的甲基化類型不會(huì)阻止限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)。如果找不到您的酶切反應(yīng)不能進(jìn)行的原因,我們推薦對(duì)照DNA底物(有多個(gè)酶切位點(diǎn)的DNA底物例如lambda DNA),進(jìn)行對(duì)比反應(yīng)。如果對(duì)照DNA底物能夠被切開而您的底物仍舊不能被切開,將兩種DNA底物進(jìn)行混合,進(jìn)一步確保DNA底物中不存在能夠抑制限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的物質(zhì)。

  • Q:

    超長(zhǎng)時(shí)間的孵育(孵育時(shí)間超過1 h)對(duì)于酶切是否存在影響?

    A:

    雷霆系列限制性內(nèi)切酶的酶活定義是以15 min反應(yīng)時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)的。增加反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該對(duì)應(yīng)著減少酶的用量,值得注意的是不同的DNA底物對(duì)于酶的需求量是不一樣的。為了使DNA底物反應(yīng)完全同時(shí)避免非特異切割,使用前一定要仔細(xì)查閱酶的反應(yīng)濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、星活性出現(xiàn)時(shí)間等。

  • Q:

    限制性內(nèi)切酶簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)一定是回文的嗎?

    A:

    大多數(shù)二型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列是回文的,而且是特定的堿基序列。然而有些限制性內(nèi)切酶具有簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn),也就是說識(shí)別位點(diǎn)中有一個(gè)或以上的堿基對(duì)是非特異的(例如:BsrfI識(shí)別5’RCCGGY, R=A/G, Y=C/T)。對(duì)于這樣的具有簡(jiǎn)并性識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶,只要是符合要求的序列皆能被識(shí)別并且被正確地切割(例如5’ ACCGGC, 5’ ACCGGT, 5’ GCCGGC, 和5’ GCCGGT,其中兩個(gè)并不是回文的,仍然能被BsrFI識(shí)別并且切割)。

  • Q:

    雷霆系列限制性內(nèi)切酶的穩(wěn)定性如何?運(yùn)輸過程中凍融會(huì)對(duì)酶的活力產(chǎn)生影響嗎?

    A:

    運(yùn)輸過程中以干冰保持低溫運(yùn)輸,酶有結(jié)冰的可能,但是這對(duì)于雷霆系列的限制性內(nèi)切酶的質(zhì)量沒有影響,我們對(duì)所有的酶都進(jìn)行了至少三次的凍融實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果表示,酶的活性仍舊是100%。您收到的酶可能是冰袋運(yùn)輸?shù)?,?qǐng)不要擔(dān)心,這僅僅是由當(dāng)?shù)氐慕?jīng)銷商運(yùn)到您的實(shí)驗(yàn)室過程中采取的運(yùn)輸方案,我們經(jīng)過嚴(yán)格的檢測(cè),暴露在4℃下經(jīng)過24~48 h后仍然不受影響。

  • Q:

    除了高溫還有什么方法能夠讓雷霆系列限制性內(nèi)切酶失活?(也不想用苯酚或氯仿)

    A:

    可以使用EDTA終止反應(yīng),或者以SDS等蛋白質(zhì)變性劑使得酶變性。如果酶切產(chǎn)物還要用于下游實(shí)驗(yàn)?zāi)敲纯梢杂媚z回收試劑盒進(jìn)行DNA清潔,回收后酶切反應(yīng)就被終止了。

  • Q:

    酶切反應(yīng)完成后跑凝膠電泳,結(jié)果條帶與預(yù)期不符,可能原因有哪些?

    A:

    可能原因有如下幾個(gè):

      • 限制性內(nèi)切酶表現(xiàn)出星活性:確保酶切反應(yīng)是嚴(yán)格按照說明書推薦的步驟進(jìn)行的。如果是由星活性引起的那么有以下幾個(gè)解決方法:①減少反應(yīng)時(shí)間;②增加反應(yīng)體系的體積;③減少反應(yīng)中酶的含量。

      • 酶切不完全(一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)有部分DNA底物未被切開),可以嘗試加多酶量或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。如果上面的嘗試不能很好地解決問題,請(qǐng)從DNA底物上尋找解決方案,DNA底物中是否含有酶切反應(yīng)抑制劑,將DNA純化后再進(jìn)行反應(yīng);DNA是否被甲基化,胞內(nèi)的甲基化系統(tǒng)能夠使DNA的特定堿基發(fā)生甲基化,而這些甲基化的堿基對(duì)于酶切反應(yīng)有著不同程度的抑制。

      • 被未知限制性內(nèi)切酶污染:未知的限制性內(nèi)切酶可能通過不當(dāng)?shù)牟僮?、不純凈的DNA底物、不潔凈的管子等途徑摻入酶切反應(yīng)中。

  • Q:

    有哪些關(guān)鍵因素會(huì)導(dǎo)致星活性?

    A:

    長(zhǎng)時(shí)間孵育、過量的酶、高甘油含量(通常高于5%)、較小的反應(yīng)體系等因素都會(huì)導(dǎo)致星活性的產(chǎn)生。

  • Q:

    未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物直接酶切要怎樣設(shè)定體系?

    A:

    反應(yīng)體系推薦由這些內(nèi)容組成:10 μl PCR產(chǎn)物、2 μl 10×CutOneTM Buffer、1~2 μl相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、ddH2O補(bǔ)齊到30 μl。酶的用量根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度而定,只加入2 μl反應(yīng)緩沖液的原因是PCR反應(yīng)中存在對(duì)應(yīng)的鹽離子和金屬離子,適當(dāng)減少反應(yīng)緩沖液的用量以保證最終反應(yīng)體系中的環(huán)境適宜限制性內(nèi)切酶發(fā)揮功能。

  • Q:

    雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力定義是怎樣的?

    A:

    雷霆系列限制性內(nèi)切酶1 U的定義是正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量。

  • Q:

    雷霆系列限制性內(nèi)切酶的活力單位與Thermo Fisher的活力單位或者 NEB的活力單位應(yīng)該如何換算?

    A:

    由于反應(yīng)時(shí)間,反應(yīng)體系不同,活力單位無法直接換算。雷霆系列限制性內(nèi)切酶活力單位是依據(jù)反應(yīng)進(jìn)行定義的,正好在15 min于20 μl的反應(yīng)總體系中將1 μg的 DNA底物在1×反應(yīng)緩沖液的環(huán)境中完全消化所需求的酶量為1 U,也就是說反應(yīng)中加入與DNA底物成比例的酶量即可完成反應(yīng)。

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